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基于适配体的生物膜干涉检测重组人促红细胞生成素α新方法

贺小琴 罗黎 郭磊 谢剑炜




摘 要 采用生物膜干涉(BLI)表面敏感光谱技术,建立了一种基于链DNA适配体39 nt的传感分析方法,实现了重组人促红细胞生成素α(EPO-α)的灵敏检测。将生物素化的39 nt固定于链霉亲和素传感芯片上,经2200 r/min高速振荡实现微升体积分析物的快速扩散。对适配体39 nt的取向、在BLI传感芯片上的固定浓度和非特异性吸附等影响因素进行了考察,发现50 nmol/L 3末端生物素化39 nt具有最佳响应信号;加入Tween 20和牛血清白蛋白(BSA)可有效克服非特异吸附。基于麦胚凝集素构建了夹心法信号放大体系,在Tris-TB生理缓冲溶液中,检测EPO-α的线性范围为10~200 nmol/L,检出限为5 nmol/L。应用于人血浆等复杂基质中的EPO-α检测,回收率为86.7%~104.2%,RSD<11%,结果令人满意。此BLI传感体系为免标记蛋白相互作用和复杂生物样品检测等实际应用提供了有益参考。

关键词 适配体;重组人促红细胞生成素;生物膜干涉;麦胚凝集素;信号放大

1 引 言

核酸适配体能够形成特定的空间结构,与靶分子通过空间互补发生特异性结合。其结合特性与抗体性质类似,因此,适配体又被称为“化学抗体”。适配体也是一类优良的分析传感元件,除直接利用其与靶蛋白间的高亲和力、高特异性结合特性外,还可利用适配体的修饰、标记、与互补序列形成竞争、与纳米器件的良好相容性等性能,发展各种分析检测和传感方法[1]。

生物膜干涉技术(Biolayer interferometry,BLI)是新兴的生物传感手段之一[2],其检测原理是光通过传感芯片的生物膜层后发生透射与反射,反射光的频率与生物膜层厚度有关。一些频率的反射光与入射光发生相长干涉,而另一些发生相消干涉,从而形成干涉光谱。BLI技术通过检测干涉光谱的相对位移变化,反映传感芯片表面生物膜的厚度。当固定于生物膜表面上的配体与溶液中的分析物结合后,生物膜层厚度增加,产生相对位移,随着分析物结合量的增加而增大,最后可达到平衡,据此进行定量分析。因此,BLI是一种表面敏感的光谱技术,具有免标记、实时、可提供分子相互作用特征信息以及简单易用等优点。目前,已有使用BLI技术的基于适配体的传感方法的报道,包括适配体结合/竞争法检测生物毒素:膝沟藻毒素[3]、石芳蛤毒素[4]、海葵毒素[5],DNA四面体结合适配体检测三磷酸腺苷[6],适配体-抗体夹心检测癌胚抗原125[7],以及酶联适配体吸附分析血小板衍生生长因子-BB[8]等。检测灵敏度多处于nmol/L或亚nmol/L水平,但多数尚未应用于实际样品测定中。BLI是通过干涉光谱的位移变化,反映传感膜表面的厚度及密度变化,通常响应信号较低,常需进行信号放大。

2019年度的诺贝尔生理学或医学奖授予了在细胞低氧感知与适应机制方面做出突出贡献的科学家,促红细胞生成素(EPO)即是该机制中的关键分子之一,作为重要的造血因子,其主要生理功能是促进红细胞增殖和分化,改善机体的携氧能力和增强耐力。在本研究组的前期工作中,针对重组人促红细胞生成素(EPO-α),发展了凝集素導向的亲和层析SELEX技术,成功筛选到了新型单链DNA(ssDNA)适配体序列807-39 nt(以下简称39 nt)[9],并结合适配体后筛选技术[10],明确了39 nt及其最短亲和性序列的高级结构特征[11],为分析、传感、诊断等应用领域提供了一类作用特点清晰的适配体元件。本研究建立了以适配体39 nt为分析传感元件的BLI新方法,将生物素化的适配体固定于链霉亲和素(SA)传感芯片上,考察了适配体的亲和性发挥,特别是研究了适配体元件的取向、固定浓度等关键因素的影响,成功构建了基于麦胚凝集素(WGA)夹心法的信号放大策略,实现了复杂基质人血浆的中EPO-α的灵敏、准确检测。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

BLITZ单样本分子相互作用分析仪(美国ForteBio公司),SA传感芯片(ForteBio公司)。SA传感芯片为即插即用式,装载固定于分析仪机身上方正中;分析仪机身下部是不同尺寸的样品池,使用时按需手动平移对准至芯片正下方。所有核酸适配体序列的变性、复性步骤于PCR仪(德国Eppendorf公司)上完成,均为95℃变性5 min,然后以1℃/min缓慢降至室温。

所有寡核苷酸序列均为上海生工生物技术公司合成,39 nt的序列为GATTGAAAGGTCTGTTTTTGGGGTTGGTTTGGGTCAATA;EPO-α(3.25 mg/mL,纯度>98.5%,深圳赛保尔生物药业有限公司);WGA、吐温20(Tween 20)、人IgG、刀豆凝集素(美国Sigma-Aldrich公司)。三羟甲基氨基甲烷(Tris)、HCl、NaCl、KCl、MgCl2、牛血清白蛋白(BSA)、铁蛋白(国药集团北京化学试剂公司)。人空白血浆由解放军第五医学中心提供。所用试剂至少为分析纯。实验前,所有的缓冲液经0.22 μm微孔水相滤膜(天津津腾公司)过滤并超声脱气。实验用水为Milli-Q A10超纯水仪(美国Millipore公司)制备的超纯水(18.2 MΩ·cm)。所有溶液使用之前,均经高压蒸汽灭菌处理。

2.2 实验方法

SA传感芯片在Tris-TB缓冲液(即20 mmol/L Tris、140 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、5 mmol/L MgCl2、0.05%(V/V)Tween-20、 5 μmol/L BSA,以HCl调节至pH 7.4~7.6)中浸泡10 min后(“水化”),依次装入到不同尺寸的样品池中(200 μL黑色离心管用于采集基线或样品的解离曲线、4 μL石英样品池用于采集样品的结合曲线),以实现上样、结合、解离和再生,温度25℃,振荡速率2200 r/min。SA芯片每日使用后吹干保存,次日经过水化处理后,即可继续使用。

检测EPO-α蛋白时,在固定了3-Bio-39 nt的SA传感芯片上,分别以含0、1、2、5、10、20、50、100、200、500和1000 nmol/L EPO-α的Tris-TB溶液作为分析物,结合时间均为300 s,解离300 s。或上述分析物的结合时间均为300 s,解离30 s,之后分别进样1 μmol/L WGA(溶于Tris-TB缓冲液),结合时间为180 s,解离240 s。50%人血浆样品由EPO-α的Tris-TB溶液与人血浆以1∶1(V/V)混合配制得到。响应曲线通过单个传感芯片自身扣减溶液空白得到,以去除或降低非特异性结合以及缓冲液自身产生的干涉光谱偏移。数据采集及拟合使用BLItz Pro1.2软件(美国ForteBio公司),拟合采用线性(定量曲线)或非线性拟合模型(1∶1结合,浓度滴定曲线)。

3 结果与讨论

3.1 BLI工作体系的构建

BLI技术是一种新型的即插即读式传感技术,可以实现单通道或多通道的同时分析。本研究采用了小型、单通道的BLITZ,其核心部件是振荡式平板(振荡频率通常在1000~2200 r/min之间)及光纤式传感芯片,样品处于敞开式样品池中,最低样品体积仅需要4 μL。与表面等离子体共振(SPR)技术相比,BLI无需与微流控系统相连,不受分子的物质迁移效应等影响,而是通过高速振荡微小体积样品,达到分析物在传感膜表面快速扩散的目的。因此,对于样品前处理要求较低,可直接针对细胞粗提液和血浆等进行分析。其不足之处在于相互作用分子固定在芯片上时,其结合性易受标记及固定策略的影响。

本研究中,适配体39 nt经单分子生物素化修饰[10]后,固定于SA传感芯片表面,引入WGA信号放大策略,构建了一种稳定、简便、灵敏的BLI分子互作体系,实现了EPO-α蛋白的灵敏检测,并用于人血浆实际样品的检测(图1)。

3.2 生物素化适配体的固定

3.2.1 生物素化适配体的空间取向 适配体分子的亲和性与其碱基排布和形成的空间结构直接相关。前期工作表明,基于ssDNA适配体 39 nt结构所发展的向左缩进(即去除3-末端碱基)分子群和向右缩进(即去除5-末端碱基)分子群,对EPO-α表现出不同的親和特性。多种分析方法的结果表明,39 nt与EPO-α结合时,其解离常数(KD)在30~90 nmol/L范围(凝胶迁移率变动分析,KD=(39±27) nmol/L[9];亲和毛细管电泳-激光诱导荧光法,KD=(86±13) nmol/L[12];SPR,KD=(54±2) nmol/L[10])。

但是,序列39 nt向左缩进,去除3-末端2、4、6个碱基时,对亲和力影响不明显(KD值上升至320~390 nmol/L),说明此段碱基主要起支撑作用;而向右缩进,去除5-末端2、4个碱基后,对亲和力影响显著(KD值上升至560~1300 nmol/L);但去除5-末端6、8个碱基后,亲和力又随之基本恢复(KD值下降至130~140 nmol/L)[10],说明此段碱基除具有支撑作用外,还具有掩蔽邻近关键碱基的作用。因此,首先考察了39 nt的5-末端或3-末端偶联上生物素后,对EPO-α蛋白检测的影响。

实验结果表明,50 nmol/L 3-末端生物素化39 nt(3-Bio-39 nt)和5-末端生物素化39 nt(5-Bio-39 nt)在SA芯片上固定300 s后,生物膜上结合响应值分别增加了1.30和1.50 nm,说明两种生物素化的适配体在SA上固定的数量较为接近。但是,当以500 nmol/L EPO-α蛋白为分析物,3-Bio-39 nt为固定分子时,EPO-α的结合使结合响应值继续升高0.33 nm,显著高于5-Bio-39 nt为固定分子的0.14 nm(图2)。说明39 nt的3-末端生物素化时,很好地利用到了该末端碱基仅起支撑作用的特点,将参与识别的关键碱基位点等尽量暴露于EPO-α蛋白,从而获得较高灵敏度。

3.2.2 用于固定的适配体浓度 在表面传感技术中,传感芯片表面配体分子的密度非常重要。固定配体密度过低,配体不能完全发挥亲和性;密度过高,则可能导致舞蹈效应(同一分析物连续作用于不同配体分子)、空间位阻效应,反而使配体-分析物间的结合降低[13]。因此,用于固定的适配体39 nt的浓度是关键实验参数之一。

如图3A所示,随着适配体浓度(25~500 nmol/L)增加,SA芯片上固定的3-Bio-39 nt数量增加,密度增大,响应信号逐渐增加。但是,对于分析物EPO-α蛋白(500 nmol/L),较低浓度适配体(50 和25 nmol/L)反而有高的结合响应值(图3B)。说明此时适配体之间存在合适的固定间距,有利于其对靶分子亲和识别。因此,选用具有最高结合响应值的50 nmol/L 3-Bio-39 nt,用于SA芯片固定。

3.3 EPO-α检测条件的优化

在缓冲溶液中加入了非离子型表面活性剂Tween 20,较好地减弱了分析物EPO-α蛋白和SA蛋白间的非特异吸附作用。实验结果表明,加入0.01%~0.05%(V/V)Tween 20后,响应信号增加了15%;再加入常用封闭剂BSA(0.1~50 μmol/L),特别是BSA浓度大于5 μmol/L时,响应信号可提升50%。

传感芯片的再生性能对于单通道多次连续测定非常重要。NaOH溶液是针对适配体-靶蛋白相互作用进行再生时的较优选择。

考察了不同浓度NaOH的再生效果(图4)。由进样前后基线响应变化可知,当NaOH浓度分别为0.1、0.05和0.02 mmol/L时,每次再生后,基线稍下降约0.02 nm。但在有限再生次数(≤10次)时,500 nmol/L EPO-α的结合响应值仍基本一致。因此,在体系再生时,根据所结合的分析物在洗脱后是否回归基线的原则选择再生次数。对于浓度小于200 nmol/L的低浓度分析物,再生条件选用0.02 mmol/L NaOH处理2~3次,每次5 s;对于浓度大于200 nmol/L的较高浓度分析物,再生条件选用 0.1 mmol/L NaOH处理2~3次,每次5 s。这也体现了单通道BLI技术工作环境敞开、方便、易控的优点。

3.4 基于适配体39 nt的信号放大型检测EPO-α

基于上述的优化条件,仅以固定的3-Bio-39 nt为亲和分子时,最低可检测到12.5 nmol/L EPO-α,但在12.5~50.0 nmol/L范围时并不呈线性响应,原因可能在于EPO-α蛋白属于较低分子量的蛋白(分子量34 kDa),其结合导致的生物膜厚度增加并不明显[2,14]。考虑到BLI检测信号与生物膜表面结合的分子数量和质量直接相关,本研究引入WGA为信号放大分子,以进一步提高EPO-α蛋白的响应。

WGA为同型二聚体糖蛋白,分子量36 kDa,每个亚单位存在两个N-乙酰氨基葡萄糖(GlaNAc)结合位点[15]。本研究组前期的工作[10]表明,WGA与适配体在EPO-α上具有不同的结合位点,WGA与适配体可与酸性糖蛋白EPO-α形成“三明治”夹心结构。由图5可见,随着WGA浓度增加,对于相同浓度的EPO-α(500 nmol/L),第二级响应信号的放大作用较为明显;WGA的浓度高于200 nmol/L时,EPO-α 检测信号显著增强。选用1 μmol/L WGA进行信号放大,实现了EPO-α的灵敏检测,线性方程为y=0.002x-0.025(R2=0.980),线性范围为10~200 nmol/L,检出限(S/N=3)为5 nmol/L。

本方法中,低(20 nmol/L)、中(100 nmol/L)、高(200 nmol/L)浓度的EPO-α的日间精密度(n=5)分别为8.2%、12.7%和9.4%。100 nmol/L EPO-α和10倍浓度的常见蛋白(如人IgG、刀豆凝集素、铁蛋白)共存时,回收率分别为86.5%±8.5%、96.1%±3.5%和95.7%±1.3%,说明常见蛋白对本方法没有明显干扰。针对50%人血浆实际样品,用本方法进行了测定,加标回收率均在86.7%~104.2%之间(表1),RSD<11%,说明本方法可用于血浆等复杂基质中EPO-α的准确测定。血浆稀释1倍后即可直接检测,方法简便,抗干扰能力强。

4 结 论

建立了基于适配体的BLI方法,实现了EPO-α的灵敏检测。优化了SA传感芯片表面固定的生物素化适配体元件的取向和浓度,利用WGA和適配体39 nt作用于EPO-α的不同位点的特性,成功构建了BLI信号放大传感体系,用于EPO-α的检测,检出限为5 nmol/L。此BLI传感体系的开发,为适配体与靶分子间相互作用研究提供了参考。借助于其它更高质量的信号放大分子(如EPO抗体)、纳米器件(如WGA或EPO抗体标记的金纳米粒子等)或酶催化方法体系,可望实现更为灵敏的检测,拓展本体系的实用价值。

References

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